在液相色譜方法開發(fā)過程中，色譜柱對于分離效果的影響是最大的。色譜柱的參數(shù)包括：鍵合相、柱長、直徑、粒徑、孔徑。

做過液相的工程師肯定都深深記牢這句口訣：

同等長度的色譜柱，粒徑越小，分離效果越好；

同等粒徑的色譜柱，長度越長，分離效果越好；

同等粒徑的色譜柱，內(nèi)徑越小，最佳的體積流速越小。

那么，在相同的方法條件下，同等長度的色譜柱，粒徑越小，分離效果一定越好嗎？小編帶您在實操中一探究竟。

案例一：兒茶酚胺及代謝物的測試

兒茶酚胺即含有鄰苯二酚（即兒茶酚）結(jié)構(gòu)的胺類化合物，包括多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素及它們的衍生物。

案例二：某雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的分離

從上兩圖中可以看出，在方法不做大的調(diào)整情況下，使用月旭AQ-C18（4.6*250mm，3μm）規(guī)格的色譜柱，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B之間的分離度僅達到1.2（圖3）。經(jīng)過多種方法的優(yōu)化，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的分離度仍徘徊在1.2左右。

更換月旭AQ-C18（4.6*250mm，5μm）規(guī)格的色譜柱，僅調(diào)整流速，雜質(zhì)A和雜質(zhì)B之間的分離度達到1.6（圖4），滿足分析要求。

原理分析：

Van Deemter方程第一項即為渦流擴散項。色譜柱中充滿了固定相填料，而這些填料的存在會阻礙溶質(zhì)分子運行，填料粒徑越大，溶質(zhì)分子“繞行"距離就越遠(yuǎn)，即在填料孔徑中停留的時間就越長。

在案例一中：兒茶酚胺類物質(zhì)屬于強極性物質(zhì)，在色譜柱上保留弱。在相同填料、相同內(nèi)徑和長度的色譜柱以及檢測條件下，相同流速的流動相對保留在3μm粒徑的UHPLC色譜柱上的兒茶酚胺類物質(zhì)的洗脫能力比1.8μm粒徑的UHPLC色譜柱的要弱，所以達到了分離度增加的效果。

在案例二中：色譜柱均為4.6*250mm規(guī)格的色譜柱，僅粒徑不同。該規(guī)格下5μm粒徑的色譜柱最佳流速為1mL/min，3μm粒徑的色譜柱最佳流速需要達到1.67mL/min，而這個流速下的壓力已經(jīng)超過HPLC的耐壓值，故無法采用最佳流速。最終，5μm粒徑的色譜柱使用的是最佳流速1mL/min，3μm粒徑的色譜柱僅使用0.8mL/min的流速，遠(yuǎn)低于最佳流速，故分離效果并沒有5μm色譜柱好。

經(jīng)過以上兩個案例，對于較難分離的分析物，小伙伴們?nèi)绻麌L試多種方法仍未達到令人滿意的分離效果，不妨嘗試把色譜填料的粒徑改大或改小，都可以試試，可能會有意想不到的效果哦！